Transparencias RNA - Transcripcin

  • Published on
    14-Feb-2017

  • View
    216

  • Download
    4

Transcript

  • Enrique Castro, 2003

    RNA: Qumica y estabilidad

    Ribosa: 2 OHConformacin en hlice AInestable a la hidrlisis

    Direccional: extremos 5 y 3

    Bases modificadas

    Estructura secundaria

    Grupo 2OH permite rpida hidrlisis

    Mezcla de 2 y 3 NMP

    Hlice exclusivamente en conformacin A

  • Enrique Castro, 2003

    Nucletidos exticos en RNAs

  • Enrique Castro, 2003

    RNA: estructura y tipos RNA ribosmico (rRNA)

    Cadena simple Alta estructura secundaria

    (hlice en bucles intracatenarios) Estructural (ribosoma) Cataltico

    RNA de transferencia (tRNA) Cadena simple Estructura secundaria media

    (hlice en bucles intracatenarios) Abundancia de bases modificadas Adaptador del cdigo gentico

    RNA pequeo nuclear (snRNA) Cadena simple Alta estructura secundaria

    (hlice en bucles intracatenarios) Ricos en U Estructural (partculas snRNP, espliceosoma) Cataltico (eliminacin de intrones)

    RNA mensajero (mRNA) Cadena simple Baja estructura secundaria Informativo: codificacin de protenas

    (madurado a partir de hnRNA)

    RNA heterogneo nuclear (hnRNA) Cadena simple Baja estructura secundaria Informativo: transcritos primarios de genes

    rRNA 16S

    120 nts (5S)1542 (16S)2904 (23S)

    80 % RNA total

    73-90 nts15 % RNA total

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin: proceso general

    Start site

    Transcripcin: polimerizacin de RNA Estructura de las RNApol Estructura de los promotores Mecanismo de la transcripcin

    Ensamblaje Iniciacin Elongacin Terminacin

    Procesamiento del transcrito primario (pre-mRNA) Caperuza 5 Corte y poliadenilacin 3 Eliminacin de intrones (splicing) Edicin

    Transporte nucleo-citoplasmtico

    promoter

  • Enrique Castro, 2003

    Convenios y nomenclatura en el sentido de transcripcin y

    traduccin

    Hebra moldeNo codificante35

    Hebra codificanteNo molde53

    mRNA 53Secuencia de hebra codificanteComplementario a molde 35

    Protena NCTraducido de mRNA 53Hebra codificante 53

    con sentido

    sin sentido

  • Enrique Castro, 2003

    RNA polimerasa bacteriana

    RNA pol de E. coli Hexmero de 465 kD (2) Requiere molde de DNA Utiliza NTP, libera PPi No necesita cebador Carece de 3exonucleasa (correccin) Transcribe todos los tipos de RNA

    (11 kD)sin funcinconocida

    DNA

    (151 kD)Liga NTPs,centro cataltico(fosfodister)se une a

    (155 kD)Liga DNA molde

    (36.5 kD)Ensamblaje del holoenzima

    unin a secuencias y protenas reguladoras

    reconocimiento del promotorvariable (70, 32, 54) :disociable

    rifampicina

    RNAn-1 + NTP RNAn + PPi

  • Enrique Castro, 2003

    Inhibidores de RNA polimerasas

    Carece de 3'OHimpide crecimiento

    (pro/eucariotas)

    Rifampicina:se une a RNApol (bacterias)impide desalojo el promotor

    Actinomicina D:intercala entre GC adyacentesdistorsiona dpleximpideprogreso de la burbuja (RNApol)(pro/eucariotas)

    -amanitina:bloquea RNApol II>RNApol III

    (eucariotas)

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin en procariotas: ensamblaje de RNApol e iniciacin

    Reconocimiento del promotor por RNApol se une inespecficamente al DNA

    (baja afinidad) Recorre el dplex buscando el promotor La subunidad reconoce el promotor

    (unin a caja -35, alta afinidad)

    Iniciacin 2 sitios de unin de NTPs en la RNApol

    Sitio de iniciacin: preferentemente A,G Sitio de elongacin: segundo nucletido

    El 3'-OH del nucletido en el lugar de iniciacin ataca y se une al -P del NTP en el otro sitio

    La RNApol transloca 1 pb y repite ciclo, alargando la cadena naciente de RNA

    Complejo promotor cerrado (Unin RNApol/DNA enrollado, Kd = 10-6-10-9 M ) RNApol se desplaza hacia la caja Pribnow.

    Desalojo del promotor Cuando el transcrito tiene 6-10

    nucletidos la subunidad se disocia

    Complejo promotor abierto La actividad helicasa de

    desenrollados 12-15 pb hasta +2. burbuja de transcripcin.

    Unin de muy alta afinidad, Kd = 10-14 M

  • Enrique Castro, 2003

    Promotores procariticos

    Caja Pribnow (-10):fusin del molde

    (desenrollado por )

    Elemento -35unin de Inicio de

    transcripcinpurina A(G)

    Elemento UP rico en AT

    aumenta expresin

    Subunidades especficas reconocen promotores diferentes

    Caja -35 Caja -10 funcin

    70 : TTGACAT TATAAT general32 : TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA choque trmico (HSP)28 : CTAA CCGATAT movilidad y quimiotaxis

    Regin de 40 pb 5 respecto al inicio2 elementos conservadosUn elemento opcional ms hacia 5 (UP element)

  • Enrique Castro, 2003

    Mecanismo de la transcripcin: elongacin

    8-9 pb6-7 nt

    17-19 pb17-19 pb13-15 pb

    Ncleo de RNA polimerasa (sin ) RNA pol es procesiva Fidelidad media (10-4 errores)

    (adecuado para transcritos de

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin en procariotas: terminacin independiente de

    Parada de la RNApol

    Liberacin del transcrito

    Mecanismo ms frecuente Secuencia seal de terminacin:

    Palndromo rico en GC: horquilla Secuencia rica en T (U)

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin en procariotas: terminacin dependiente de

    Mecanismo menos frecuente

    Seales de terminacin dependientes de sin secuencia definida se une a secuencias especficas

    en el transcrito Migra 53 hasta la burbuja transcripcional Actividad DNA/RNA helicasa

    (ATP-dependiente)

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin en eucariotas

    Estructura del mRNA eucaritico: Caperuza 5 (estabilizacin) 5 UTR (regulacin) Regin codificante 3UTR (regulacin) Cola de poli-A 3' (estabilizacin)

    Caperuza 5

    5 UTRRegin codificante

    3 UTR

    Cola poli-A 3

  • Enrique Castro, 2003

    RNA polimerasas eucariticas

    Tres polimerasas diferentes RNApol I: pre-rRNA (nucleolo)

    RNApol II: general (mRNA)

    RNApol III: genes RNA (tRNA, snRNA etc)

    Sensibilidad a -amanitina Pol II > polIII >> polI, RNApol bact 10 M 100M

    2 subunidades grandesRPB1, RPB2 (130-220KD) homlogas a , de E. coli

    Protenas grandes multimricas12 subunidades (500-700 kD)

    2 subunidades homlogas a la

    de E. coli RPB3 (20-40 kD)

    Estructura y funcin conservadas

    Interaccin con promotores A travs de RPB4 Requiere factores adicionales especficos de promotor RNApol III reconoce seales 3

    Factores de Transcripcin

    5 comunes4-7 especficas

  • Enrique Castro, 2003

    RNA polimerasa II

    RPB2: unin a DNA

    Dominio CTD de RPB152 repeticiones deYSPTSPS

    Transcripcin de genes de protenas Reconoce variedad de promotores

    Ampliamente regulable

    Requiere al menos 7 factores de transcipcin generales

    Dominio carboxi-terminal (CTD) fosforilable

    2 subunidades grandesRPB1 (220 kD), RPB2 (150 kD)

    homlogas a de E. coli

    RPB1: unin a NTPs(cataltica)

    Procesamiento del pre-mRNA

    PP PP

    Hasta 50 nm

    Regulacin por fosforilacin mltiple

    Funciones de CTD: Regulacin Unin al promotor: desfosforilado Iniciacin: fosforilado Unin de protenas accesorias

  • Enrique Castro, 2003

    Promotores eucariticos: promotor proximal (core promoter)

    Caja TATA

    Iniciador

    Caja GC

    Estructura de un gen de mamfero:Exonesintrones y UTRs

    start

    -200 -30

    -10 / -50 kb

    +10 / +50 kb

    Elementos potenciadores

    Promotorproximal

  • Enrique Castro, 2003

    Promotorbasal

    Promotor Proximal

    l

    INR -3 a +5NYYANT/AYY

    Elementos reguladores Cis (secuencias promotoras) y

    Elementos reguladores trans (factores de transcripcin)

    Tanto los elementos reguladores Cis (basales, proximales y distales), como los elementos reguladores trans (factores de transcripcin) se caracterizaron usandouna combinacin de tcnicas de DNA-footprinting y Cromatografa de afinidad.

  • Enrique Castro, 2003

    Factores de transcripcin asociados a RNApol II

  • Enrique Castro, 2003

    Pasos clave en la transcripcin del DNA por RNApol II

    Ensamblaje: Reconocimiento del promotor

    Unin de RNApolII (CTD desfosforilado)

    Construccin secuencial y ordenada del complejo de iniciacin

    Iniciacin: Apertura del complejo

    Activacin de la RNApol

    Fosforilacin del CTD

    Desenrollado del molde y activacin de la polimerizacin

    Actividad de TFIIH

    Elongacin: Disociacin de factores generales

    Reclutamiento de factores de elongacin Reclutamiento por CTD de RNPs para procesado

    (capping, splicing)

    Crecimiento del transcrito por polimerizacin de NTPs sobre

    el molde

    Terminacin: Reclutamiento del complejo de poliadenilacin

    (reconocimiento de la seal AUAAA)

    Corte y liberacin del transcrito: desactivacin de RNApol

    Poliadenilacin 3

    Acoplamiento de corte y poliadenilacin con terminacin

    Hasta el complejo de preiniciacin

    Hasta el desalojo del promotor

    Mientras no termine

  • Enrique Castro, 2003

    Ensamblaje de RNApol II sobre el promotor

    3. Reclutamiento de RNApol II

    unida a TFIIF CTD desfosforilado

    TFIIF inhibe la unin no especfica a sitios no promotores

    9 subunidadesSe une a TFIIB

    Complejo de iniciacincerrado

    Complejo de iniciacinabierto

    Complejo de pre-iniciacin

    (PIC)

    TFIID=TBP o similar11 TAFs

    1. Reconocimiento de promotor unin de TBP unin de TFIID ( y/o TFIIA)

    2. Unin de TFIIB Recluta RNApol

    4. Formacin del complejo cerrado

    unin de TFIIE unin de TFIIH

    5. Apertura Actividad helicasa de

    TFIIE y TFIIH

  • Enrique Castro, 2003

    Inicio de la transcripcin por RNApol II

    Helicasa deTFIIH

    Quinasa deTFIIH: Fosforilacin mltiple en CTD Activacin de RNApol II Disociacin de TFIID/TBP-TFIIB

    Liberacin de TFIIE/H

    Elongacin

    Seal de terminacin

    pTEFbFactores generales disociados

    reutilizacin

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento del mRNA eucaritico

    Reclutamiento de la capping enzyme

    capping enzyme

    Reclutamiento de la maquinaria de splicing

    (RNPs)

    Reclutamiento de la maquinaria de corte

    y poliadenilacin

    maquinaria de splicing (RNPs)

    mRNA/RNPs

    PIC

    Simultneo a la elongacin Factores reclutados por P-CTD

    Caperuza formada en lala transicin iniciacin-elongacin(mRNA naciente 20-40 Nts)Requiere desfosforilacin en Ser-5

    Requiere fosforilacin en Ser-2por pTEF2b(quinasa)

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento del mRNA: Formacin de la caperuza 5

    Capping enzyme

    Sntesis: Durante iniciacin-elongacin (25-30 nts) Enzima ligada a CTD-P de RNApol II

    Funciones de la caperuza: Proteccin de 5exonucleasas Exportacin del ncleo Reconocimiento por ribosomas

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento del mRNA: poliadenilacin 3

    G/U

    G/U

    80-250 nts

    10-30 nts 20-40 nts

    cleavage site

    Seal de terminacin en DNA/transcrito: Reclutamiento de endonucleasa Corte del transcrito termina la accin de RNApolII Catalizado por componentes RNP

    AAUAAAmuy conservada

    Rica en G/Umuy degenerada

    Funciones: Estabilizacin 3 Reconocimiento por RNPs

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento del mRNA: poliadenilacin 3

    CPSF forma complejo inestable con

    AAUAAA

    CStF se une a G/U

    Unin de CFI y CFIIcomplejo estable unido a seales de terminacin

    Se recluta poli-A polimerasa

    Unin de PAP activa endonucleasa:corte 3 de AAUAAA

    Liberacin de factores

    Poliadenilacin lenta

    Poliadenilacin rpida

    Reclutamiento de PABII

    PABII estimula a PAP

    Corte seala terminacin a RNApol II

    Previene terminacin

    por RNApol II

  • Enrique Castro, 2003

    Intrones eucariticos: gen y mRNA de la ovoalbmina de pollo

    3UTR

    1158 nts386 aa

    DNA genmico

    mRNAmaduro

    Intrones: bucles extra(no codificante)

    DNA genmico del gen de ovoalbmina hibridado a su mRNA

    Exones: Elemento funcional Dominio estructural Variabilidad/combinatoria

    Intrones: Seales de control Variabilidad/

    combinatoria

    30-100 aa

    100-20.000 nts

    5UTR

  • Enrique Castro, 2003

    Estructura de los intrones

    Exn 3Exn 5

    Intrn

    Punto de ramificacin

    Seales identificadoras Lmite 5: GU Punto de ramificacin (A),

    a 20-50 pb de 3 Regin rica en pirimidinas (15 pb) Lmite 3: AG

    Zona rica en Pir

    Corte y empalme: A partir de bordes 5GU y AG3 Punto de ramificacin es esencial Exclusivamente en el ncleo El sustrato de splicing es

    transcrito+caperuza+poli-A Catalizado por partculas snRNP

    (espliceosoma) snRNAP reclutadas por CTD-P de

    RNApol II

    Seal GU:Sitio de empalme 5

    GU A/G A G U U A/G A C/U C AG G A/C A G 70 60 80 100 95 70 80 45 90 80 100 80 80 100 60

    20-50 pb

    100 20000 pb

    Frecuencia deaparicin, %

    Seal AG:Sitio de empalme 3

  • Enrique Castro, 2003

    Splicing: Corte y empalme de intrones

    Lazo: blucle cerrado covalentemente. Enlace 5G-2A

    Degradado rpidamente

    Exones ligados en orden

    2 transesterificacin.3-OH de exn 1 ataca AGpX

    1 trans-esterificacin.2-OH de A ataca pGU 5

    Exn 1 (5')

    Pre-mRNA

    2 reacciones de trans-esterificacin sucesivas

    Autocorte: Tipo I algunos rRNA, rRNA Tipo II (plantas, hongos)

    No autocorte: Genes estructurales tRNAs

    Exn 1 (5') Exn 2 (3')

    Requieren catalizador: snRNP

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento de intrones; estructura y funcin de snRNPs

    Partculas snRNP Catalizan splicing 5 snRNAs 50 protenas

    Ensamblaje requiere ATP Reclutados por CTD-P de

    RNApol II

    RNPngenerales y especficasMotivos de unin a RNA (RBD, RGG, KH)

    U1, U2, U4, U5, U6 (U11,U12)100-200 nts. muy conservados

    Funciones de Un snRNA Hibridacin: reconocimiento de seales Forman el lazo al reunir los extremos 5 y 3 Catlisis de transesterificacin: ribozimas

    Funciones de RNPs Previene degradacin snRNA Previene plegamientos secundarios de RNA Reconoce secuencias seales Recluta otras protenas Transporte nucleocitoplasmtico

    U1: reconocimiento de 5GU(o bien U11)

    U2: unin al punto de ramificacin(o bien U12)RNP1, RNP2

  • Enrique Castro, 2003

    Corte y empalme en el espliceosoma

    Funciones de snRNA: U1: une a extremos 5 y 3 U2: une a ramificacin

    (cataltico) U4: mantiene inhibido U6 U5: se une a 5 U6: cataltico

    U6 hibridado con U2 y centro de empalme 5 simultneamente

    Reordenamiento interno(rehidridacion)

    Otros espliceosomas usan U11 y U12

    reutilizacin

  • Enrique Castro, 2003

    Procesamiento alternativo de intrones

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin y procesamiento de pre-rRNA en eucariotas: RNApol I

    +1rRNA promoter

    SL1:multimrico

    TBP

    +1

    Core elementUCE

    -150 -100 pb

    Ensamblaje: UBF se une a UCE se une SL1 Se une RNApol

    Activacin e iniciacin NO requiere ATP

    2OH ribose,100 nucleotides

    Exclusivamente en el nucleolo

    snoRNPs(snoRNAs)

    snoRNAs: from genes & introns

    Terminacin por factor especfico unido en 3

    RNApol IUBF

  • Enrique Castro, 2003

    Transcripcin por RNApolIII

    +1A B

    +1C

    rRNA 5S

    tRNA

    Elementos decontrol internos

    +1

    +1

    RNApol III

    RNApol III

    TFIIIB

    TFIIIB

    TFIIIC

    TFIIIC

    TFIIIA

    tRNAs

    TBP

    rRNA 5S

    Ensamblaje

    Unin TFIIIC aA-box y B-box

    Unin TFIIA a C-box

    TBP

    tRNA-nucleotidil transferasa.molde interno: 3 sitios de unin

    ribozima Intrn

    Terminacin por seal poli-U (no horquilla)

    Transcripcin de:tRNAsrRNA 5SRNAs pequeos (snRNAs, snoRNAs)

    Procesamiento: (en nucleoplasma)

    No en espliceosomamecanismo especial

  • Enrique Castro, 2003

    Exportacin de mRNAs al citosol

    mRNP:mRNA maduroprotenas RNPprotenas CBC

    Las protenas son exportadas. mRNA va ligado

    Unin al ribosoma

    NPC transporta activamente

    sin intronesdesligado del espliceosoma

    Seales NES y NLS

    No exportado = degradado(talasemias)

    Sistema de vigilanciaexosoma

    (3 exonucelasas)

    (snRNPs no se exportan)

    Exportacin:Secuencias NESUnin a exportinaRequiere energa

    hnRNP A1(NLS hidrfoba)

  • Enrique Castro, 2003

    Transporte ncleo-citoplasma: protenas G pequeas (ran)

    Exportina reconoce NES rica en Leu

    GAP: Hidrlisis de GTP

    3 NESconocidas

    Unidireccionalacoplado a hidrlisis de GTP

    Transporte retrgrado(seal ??)

    Transporte activo por poro nuclear

    NES reconocida por transportadorTransportador = exportina Unin a protena G ran

    Transporte unidireccional:Unin slo a GTP-ranDistribucin asimtrica de GAP/GEF

    GEF: intercambio GDP/GTP

  • Enrique Castro, 2003

    Transporte citoplasma-ncleo: y protenas G pequeas (ran)

    2 NLS conocidas(bsica, hidrofbica)

    Unidireccionalacoplado a hidrlisis de GTP

    Complejo -importina/carga es transportado activamente (-NPC, ATP-dependiente)

    NLS reconocida por transportadorTransportador=importina (NLS bsica)

    transportina (NLS hidrfoba)Unin a protena G ran

    hnRNP A1(NLS hidrfoba)

    Diferencias:Ran-GTP une transportador vacoImportacin es activaRequiere factores adicionales (NTF2)

    GAP: Hidrlisisde GTP

    Transporte unidireccional:Unin slo a GTP-ranDistribucin asimtrica de GAP/GEF

    GEF: intercambio GDP/GTP

  • Enrique Castro, 2003

    transporte ncleo-citoplasma

    Exportacin de partculas pre-ribosmicas

    5S RNA

    28 S RNA5.8 S RNA5 S RNA

    nucleoloncleo

    Importacin de protenas

    Partculaspre-ribosmicas

    18 S

    Subunidades ribosmicas

    Importacin de protenas RNPs

    snRNA

    snRNPs

    Protenas RNP

    Caperuzaadicional

    snRNPs

    Importacin activa

    Importacin de factores citoplsmicos

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin de la expresin gnica: genoma y proteoma

    Funciones codificadas por genes humanos

    Control gnico: Qu genes se expresan

    En qu momento

    Con qu pauta temporal

    Regulacin:40-50%

    Tipos de genes: Constitutivos

    Inducibles

    Represibles

    Esquema de diferenciacin tisular

    Programas de diferenciacin celular

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin de la expresin gnica

    Gen

    Transcripcin

    Procesamientopost-transcripcional

    Traduccin

    Modificaciones post-traducionales

    Proteolisis

    Hidrlisis del mRNA

    nucletidosTranscrito primario

    mRNA maduro

    Protena(inactiva)

    Protena(activa)

    aminocidos

    Funciones fisiolgicas

    Expresin gnica

    biosntesis degradacinEstado estacionario

    Todos los procesos son regulados

  • Enrique Castro, 2003

    Control de la expresin gnica en procariotas: operones bacterianos

    Protena unida:transcripcin bloqueada

    Disociacin: alivio de la inhibicin

    Nivel basal de transcripcin elevado

    Regulacin por represin Protenas de control simples

    Organizacin gnica en operones:Unidad de transcripcin policistrnicaSecuencias de control nicasControl conjunto por represor

    Acoplamiento Transcripcin/Traduccin:Regulacin conjunta

  • Enrique Castro, 2003

    Control gnico en eucariotas: caractersticas generales

    Integracin Control combinatorioControl alternativo

    proteoma>>genoma

    Mecanismo principal: control de la estimulacin

    de la iniciacin

    Transcripcin(ncleo)

    citoplasma

    HistonasrRNA

    Silenciamiento gnico(epigentico)

    Nivel basal de transcripcin nulo Cromatina muy condensada Acceso al promotor restringido

    Regulacin por activacin Organizacin jerrqica

    Organizacin gnica dispersa unidades de transcripcin monocistrnicas Control individualizado de genes Seales de control mltiples Protenas reguladoras complejas

    Procesamiento del transcrito Variabilidad en splicing

    Desacoplamiento transcripcin/traduccin Transporte al citosol regulado Regulacin de la tranduccin

    Mecanismos de regulacin Dosis gnica Metilacin del DNA Condensacin de la cromatina Control de la iniciacin Regulacin de la elongacin/terminacin Splicing alternativo Edicin del mRNA Transporte nucleocitoplasmtico Estabilidad del mRNA Regulacin de la sntesis de protenas

  • Enrique Castro, 2003

    Empaquetamiento DNA/Histonas:promotores inaccesibles a factores TAF, RNApol elementos reguladores

    Para la transcripcin, el DNA debe remodelarse sin llegar a desorganizarse

    El empaquetamiento de los cromosomas metafsicos bloquea todo acceso al DNA

    Cromatina condensada No hay transcripcin

    Cromatina relajadaSi hay transcripcin

    Estructura de la cromatina y control de la transcripcin

    HAT

    HDAC

    Cromatina activa: Pobre en H1 Poco metilada (CpG) Rica en HMGs Histonas acetiladass

    Sensibilidad a la DNasa I(promotor: sitios hipersensibles)

  • Enrique Castro, 2003

    Complejos reorganizadores de la cromatina

    Cambio conformacionalATP-dependiente

    Activacin: AcetilacinHAT

    HDAC

    HAT

    HDAC

    actividad oligmeropCAF/SAGA HAT >20mSIN3 HDAC >10SWI/SNF Remodelado >11

    Reclutado por transactivadores/mediador/co-mod

    pCAFSWI

    mSIN3

    Subunidades compartidas con Mediador/THIID

    Actividades enzimticas Reorganizacin del nucleosoma Acetilacin de histonas

    Reclutados por Trans-moduladores Co-moduladores Mediador

    HATsHDACs

    Represin: Desacetilacin

    Ensamblaje: HATs B CAF1 (H3/H4) NAP1 (H2A/H2B)

  • Enrique Castro, 2003

    Amplificadores: Trans-activacin

    Elementos potenciadoresExonesintrones y UTRs

    -200 -30

    -10 / -50 kb+10 / +50 kb

    PIC Complejo de preiniciacin

    GTFs + RNApolProtenas reguladoras unidas a elementos de controlTransactivadores

    Interaccin activadora:

    Mediador/TFIIDCo-activadoresCo-represores

    TFIID:TBP11 TAFs

    Mediador:>20 subunitsunido a CTD

    Se unen al PICReclutan transactivadoresReclutan remodeladores

    Accin a distancia: Mecanismo de bucle

    Unin a surco menor:curva en DNA dplex

    cooperativas

  • Enrique Castro, 2003

    Amplificadores eucariticos: elementos cis

    Ncleo del promotor:(core promoter)

    Prximo a +1 Unin de RNApolII

    ATFGTGACGTATFNF-BGGGACTTTCCBOct-1ATTTGCATOctmeroSP1GGGCGGGC boxC/EBP, CTF1GGCCAATCTCAAT boxfactors. consensoelemento

    RAR/RXRAGGTCAN5AGGTCARAREGRAGAACAN3TGTTCTGRESRFSRFAP-1TRECREBCREfactorsec. consensoHRE

    Todos los anteriores +Elementos de respuesta

    a hormonas choque trmico (HSTF)

    TATAGC-boxInr

    Elementos proximales:Posicin cercana (hasta -200 pb)Siempre 5Orientacin fijaAfectan al promotor inmediato

    Amplificadores:Elementos distales (0.1-50 kb)5, 3 y en intronesOrientacin bidireccionalControlan grupos de genes

  • Enrique Castro, 2003

    Elementos trans:Factores de Transcripcin

    Dominios de unin a DNA (DBDs):-hlice protrusiva Contactos con surco mayorUnin a secuencias especficasSin desaparear bases(sin desenrollar)

    Muy conservados80% en tres categoras

    HTHDedos de ZnbZIP

    Funcin: Unin a elementos de control cis (DNA) Regular iniciacin

    Estructura: Modulares

    D. unin a DNA (DBD)D. de activacin (AD)Interaccin protena-protena

    Dimricos

    AD DBD SP1

    AD DBD LBD GR

    DBD AD Gal4

    reclutamientoactivacinrepresin

    N C

    -hlice 1.2 nm Surco 1.2 x 0.6-0.8 nm

    No existe un cdigo constanteImposible predecir secuencias

    Integracincombinatoria

    surco menor

    surco mayor

  • Enrique Castro, 2003

    Estructuras de dominios DBD

    Homeodominio

    Dedos de Zn

    C2H2

    Cx

    20 aa

    60 aa

    30 aa

    60 aa

    SP1

    NR

    Interaccin protena-protena

    60 aa

    bZIP:Cremalleras de leucina bsicas

    hlice-giro-hlice(HTH)

  • Enrique Castro, 2003

    Dominios de transactivacin: mdulos independientes

    Dominios de transactivacin: Diversidad estructural Cambio conformacional por unin a DNA Interaccin con co-activadores

    (reclutamiento)

    Tipos de dominios Acdico Rico en Q Rico en P Rico en S y T

    Hidrofbicos Bsicos

    Se pueden intercambiar mdulos en protenas quimricas

    Ovillo -hlice anfiptica

    Un dominio AD rico en P transactiva desde un elemento GC

    Represin

    muy potente promiscuo (todo tipo de genes)

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin de los factores de transcripcin

    Regulacin de la unin al DNA por: Expresin diferencial (induccin) Fosforilacin/desfosforilacin Unin de ligandos Localizacin/secuestro

    inactivo

    activo

    PP

    ATP

    ADP

    P

    P

    P

    inactivo

    activo

    Sntesis proteica

    Unin de ligandos

    Fosforilacin/ desfosforilacin

    Localizacin/ secuestro

    CREBSRF

    E2F/Rb

    NF-B NF-AT Notch

    proteolisiscitosol citosol

    ncleo ncleo

    La expresin gnica es controlada por seales celulares

    fosjun

    NR(ER,TR.RAR)

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin gnica: organizacin jerrquica

    Organizacin jerrquica: Cascadas de reguladores

    Regulacin alternativa: Varias rutas para cada gen Activacin/represin

    coordinadas

    No transcripcinSupresin de protenas activas

    Protenas activas

    Respuesta fisiolgica celular

    Seal

    Activacin del reguladorUnin

    al DNA(y otras acciones)

    Expresin de un nuevo regulador

    que controla varios genes

    Expresin de reguladores secundarios

    Trans-activacin

    Trans-represin

  • Enrique Castro, 2003

    Mediadores del Mediador: co-activadores y co-represores

    CBP/p300

    TAFs

    CAF

    Med

    Los transactivadoresNO se unen a PIC:Protenas de intermediacin

    Remodelacin?

    Unin a Histona-Ac(cromatina activa)

    EstabilizacinReclutamientoUnin a trans-moduladores Unin a Inr etc

    promotores sin TATA

    Subunidades compartidas entre complejos

    TFIID/ Mediator/ pCAF(SAGA) etc

    Papel Central

    Red compleja de interacciones protena-protena

    Co-moduladores: Centros de interaccin (construccin del complejo proteco)

    Reclutamiento de otros factores(Remodelamiento/HAT)

    TFIID/TAFs: Similar a histonasBromodominiosInteracciones protena-protenaReconocimiento de promotorConstruccin de PIC

    Mediador: Multimrico (20 p)Interacciones protena-protenaReclutado sobre PIC-CTD

    Co-activadores:N-CoA, CBP/p300Co-represores: N-CoR

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin gnica: Integracin cooperativa de seales

    Complejo multiproteico:Enhanceosome Potenciosoma?

    Regulacin del gen de la transtiretina en hepatocitos

    Puntos de inicio alternativos Construccin por reclutamineto Construccin cooperativa

    Generales +

    especficos de tejido

    GTFs

    Compleja red de interacciones

    Trans-moduladores

    co-moduladores TFIID

    Mediator

    RNApol IIPIC

    remodelacin

  • Enrique Castro, 2003

    Integracin combinatoriade seales

    AP-1: combinacionesde fos/jun/otros

    El orden puede ser

    significativo

    Puede combinarse

    con represores

    repeticionessimetra

    Aumento factorial de las opciones de regulacin Homo/Heterodimerizacin

    Reconocimiento de seales cis

    Interacciones protena-protena

  • Enrique Castro, 2003

    Trans-represin

    Construccin del complejo de amplificacin impedida

    No hay transcripcin

    Gen EGR-1

    AP-1SRF

    -1 kb

    RepresorWT-1

    Elementos de control

    Esencial en el desarrolloTumores posteriormente

    Ejemplo: tumores de Wilms

    Inverso funcional de la trans-activacin

    Esencial para una red de control

    Mecanismos de represin: Competicin por unin al DNABloqueo de dominios ADBloqueo del reclutamiento de

    Co-activadoresTFIID/MediadorGTFs

    Reclutamiento de remodeladores compactacin/desacetilacin

  • Enrique Castro, 2003

    Controles de largo alcance

    : saco vitelino:hgado fetal,:mdula sea adulta

    LCR: compactacinde la cromatina

    Slo activado en clulas eritroides

    Cada gen tiene controles individuales

    Actan por unin de protenas

    Controles de grupos gnicos Afectan a grupos de genes coordinados Remodelado de la cromatina

    Aisladores (elementos frontera) Limitan accin de amplificadores Previenen efecto de posicin

    Delecin causa talasemia

  • Enrique Castro, 2003

    Regulacin de la expresin gnica:Edicin del mRNA maduro

    conversin en codn stop

    hgado intestino

    No se une a LDL-RNo cede colesterol

    Se une a LDL-RCede colesterol a tejidos perifricos

    Dominio de unin a LDL-R

    Desaminacin:CUAI

    Edicin:Cambiar la secuencia del mRNA maduroMuy frecuente en mitocondrias y cloroplastos

    Mecanismo de edicin: Modificacin de bases in situReconocimiento de secuencia por RNA

    Apo-B100 (500 kD): hepatocitosApo-B48 (240 kD): intestino

    Receptores de glutamato tipo AMPA:Permeabiliadad al Ca2+(plasticidad sinptica: memoria)

    Apolipoprotena B

  • Enrique Castro, 2003

    Metabolismo citoslico del mRNA

    Degradacin lenta progresiva de cola ppli-A

    Acelerada por seales de AUUUA en 3UTR

    Reclutamiento de endonucleasa especfica

    Seales codificadas en 5UTR y 3UTR

    Recambio: via adicional

    Recambio: via principal

  • Enrique Castro, 2003

    Estabilidad del mRNA: opciones de regulacin

    Regulacion de la estabilidad del mRNA de TfR por Fe

    IRE-BP activa (no Fe)protege de la degradacin

    Secuencias AUUUA repetidas en 3UTRReconocimiento por nucleasas

    mRNA

    5cap 3 UTR 3 Poli-A

    Estable

    Lbil

    Seal de degradacin rpida

    Unin especfica a secuencias de bucle IRE

    Recambio constitutivo:mRNAs son muy estables en eucariotasDegradacin por sistema enzimtico especfico

    Degradacin regulada: Aumento de degradacin: seal 3UTRAumento de estabilidad

    sistema caseina/prolactinasistema TfR/Hierro (IREs )

    Citoquinasgenes inmediatos tempranos

  • Enrique Castro, 2003

    Los elementos IRE tambin regulan la traduccin del mRNA

    Fe disponible para Fe-enzimas

    Fe secuestrado por ferritina

    Elementos IRE en 5 UTR

    Unin de IRE-BP previene iniciacin de traduccin

    No modifican degradacin

  • Enrique Castro, 2003