DNA Mitocondrial (mt). Características de las Mitocondrias  Promedio general de mitocondrias/célula: 500 a 1000  Los eritrocitos no tienen mitocondrias.

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    22-Jan-2016

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  • DNA Mitocondrial (mt)

  • Caractersticas de las Mitocondrias Promedio general de mitocondrias/clula: 500 a 1000 Los eritrocitos no tienen mitocondrias (ni ncleo) Las plaquetas tienen slo mitocondrias y no DNA nuclear Los linfocitos maduros tienen 10 a 50 organelas Los ovocitos llegan a tener entre 100.000 a 200.000 mitocondriasExisten entre 2 a 10 molculas de DNAmt; ribosomas mt; tRNA mt y subunidades enzimticas (elementos estrucuturales de la MI) que forman los complejos respiratorios I-IV encargados de OXPHOS (fosforilacin oxidativa).Su tamao vara entre 0.5 y 1 mFormadas por una membrana lisa externa y una interna (crestas mitocondriales)

  • Molcula circular (16569 bp en humanos). Secuencia completa: Anderson, et al., 1980./ Secuencia de Cambridge

    Cadenas complementarias asimtricas H rica en bases G L rica en bases C Caractersticas del DNA mitocondrialCarece de intrones, los genes se ubican uno a continuacin del otro.

    Slo dos regiones de secuencias no codificantes: 1) Entre los extremos de los genes tRNAlisina y ATPasa8 (58294-38301) (9bp). 2) D-Loop (Asa D o RHVI) 16024-576 (1121bp).

  • DNA Polimerasa gamma (). Codificada en el DNA nuclear 15q26. Tiene actividad exonucleasa 3-5.

    Sntesis de DNA 1. Separacin de las cadenas complementarias a nivel del OHSimultneamente inicio de la sntesis de la cadena H 3-5 (molde la cadena L)2. Estructura triple cadena se mantiene hasta que la sntesis progresa a los 2/3 del DNAmt y alcanza el OL (origen de replicacin de la L); comienza la sntesis de la cadena L en direccin opuesta usando la H como molde.

    Duracin total: 2 horas a una velocidad de 270nt/minuto por cadena; es 100 a 200 veces ms lenta que la nuclear.Replicacin y transcripcin del DNAmtReplicacin:Transcripcin:Las dos cadenas se transcriben; el D-Loop contiene un promotor para cada cadena

    En mamferos, existen pequeas variaciones en el cdigo gentico del DNAmt con respecto al cdigo gentico universal (ej: posee 4 codones de stop).

    Transcripcin y traduccin ocurren en la mitocondria

  • Estructura en triple cadena de DNA: una L y una H complementarias + una H sola.El D-Loop contiene los promotores de inicio de la transcripcin de la cadena H (PH) y de la cadena L (PL), as como el origen de replicacin de la cadena H (OH)

  • Replicacin del DNAmt: modelo asimtricoLa replicacin del DNAmt ocurre mediante un mecanismo de desplazamiento asincrnico que involucra dos orgenes unidireccionales ubicados en distintas cadenas.D-loopD-loop expandido

  • Lo hereda la madre a todos sus hijos y las hijas a los propios. Las mitocondrias del espermatozoide maduro (60-70) se ubican en la pars intermedia generando energa para la motilidad. Al momento de la fecundacin slo entra la cabeza del espermatozoide y tal vez algunas pocas mitocondrias.Ante la gran cantidad de dotacin materna versus pocos genomas mt masculinos (se pierden) la herencia se convierte en exclusivamente materna. No existe recombinacin, los genes mt estn en estado de haploide. La nica variacin posible ser debida a mutaciones.Herencia del DNAmt

  • 10-20 veces que el genoma nuclear.Asa D de 100 a 200 veces . El D-Loop es la regin del DNAmt ms lbil a mutaciones Por qu?

    Causado por 3 factores:

    1) Mquina productora de energa genera ROS (reactive oxygen species)

    2) Ausencia de Histonas accin deletrea ROS

    3) Reparacin de daos deficiente a causa de la baja eficiencia de reparacin de la polimerasa .Frecuencia mutacional del DNAmt

  • El genoma mt tiene frecuencia mutacional # de genomas mt/mitocondria/clula/individuoMezcla entre genomas mutados/ genomas heredados>>> HeteroplasmiaHomoplasmiaHeteroplasmiaConcepto de homoplasmia y heteroplasmia

  • Origen: Algn defecto en las rutas metablicas de produccin de ATPCausas: Mutaciones en el DNAmt o en el DNA nuclear (Por qu?) Variable Comienzo a cualquier edad Afecta rganos no ligados embriolgicamente pero con consumo de energa Perodos libres de sntomasExpresin clnica :Tipos de cncer: Colon Mama Gstrico RenalEnfermedades mitocondriales

  • Mutaciones del DNAmt asociadas a enfermedades en humanosWallace et al., 1997. Sci. Amer. 277:40

  • Existe una secuencia poliC en el D-Loop entre las bases 16184-16193 :Sucesin de 9C interrumpidas en la posicin 16189 por una T. CCCCCCCCCC TMnl I CCTC N7 transicin T>C o C>T la enzima la reconocerPolimorfismos del DNAmtEl Asa D (o D-Loop) es una regin hipervariable

  • 1. PCR. Primers: MiL 16108 5CAG CCA CCA TGA ATA TTG TAC3 MiH 16401 5TGA TTT CAC GGA GGA TGG TG3

    Gel de Agarosa 2% (fragmento de 312pb). Verificar la amplificacin.

    Digestin con Mnl I del fragmento amplificado.

    4. Gel de poliacrilamida 10% . Visualizacin de los patrones de digestinMetodologa para el anlisis de RFLP

  • Secuencia de Anderson (Cambridge)

  • Ejemplo de patrones de RFLP del DNAmt

  • 150bp125bp100bp50bp25bpEjemplo de patrones de RFLP del DNAmtL L = Ladder 25 pbMuestras de alumnos y sus familiares

  • Localizar los primers en la secuencia de AndersonBuscar todos los sitios lbiles a nuevas mutaciones (transiciones TC o CT)Tarea para la prxima clase (19/05):Traerlo impreso (1 trabajo/grupo)Localizar los sitios de reconocimiento y corte de la enzima Mnl I en la secuencia de Anderson

  • Una vez definidos en el gel de poliacrilamida sus propios patrones, realizar los mapas de restriccin para cada muestraTarea para el informe (fecha lmite de entrega: 16/06)Patrn de Anderson:Ejemplos:

  • Exposicin de papers: lunes 02/06Un paper por grupoPapers:Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled mechanism (paper).Mitochondria as Decision-Makers in Cell Death (review)Transcription and replication of mitochondrial DNA (review)Mitochondrial dynamicsfusion, fission, movement, and mitophagyin neurodegenerative diseases (review)Alrededor de 20 minutos de exposicin por grupo

  • Mix de PCR1 Tubo64.4 l10 Tubos

    ReactivosConc finalpremix X1 (ml)premix X 10 (ml)Buffer 5X1 X3.030dNTPs 10 mM0,2 mM0,33.0Primers Mit 25 mM0,25 mM0,151.5Mg+2 25 mM1,5 mM0,99.0TAQ 0.6 ul/100 ul0,090,9DNA 50 ng220H2O85.6total mix (ml)Vf = 15 mlVf = 150 ml

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